تبلیغات
مرکزمهندسی پزشکی شیراز - توضیحات کامل در مورد الایزا ریدر
آشنایی با ما
با سلام ( خوش آمدید )

این سایت در جهت معرفی علوم نوین بین رشته ای از جمله مهندسی پزشکی ، مهندسی هسته ای و پرتو پزشکی ، مهندسی برق و الکترونیک و رباتیک و کاربردهای آن در جهت کمک به مهندسان ، پزشکان ، دانشجویان عزیز و سایر علاقمندان در سرتاسر کشور عزیزمان به ویژه همه دانشجویان دانشگاه شیراز و دانشگاه علوم پزشکی شیراز در سال 1391 شروع به فعالیت کرد. همچنین این وبسایت با همکاری مرکز رشد تجهیزات پزشکی دانشگاه علوم پزشکی شیراز در جهت ارتقا سطح علمی و دست یابی راحت دوستان به مقالات علمی مهندسی پزشکی و همچنین مکانی برای تبادل نظرات و پیشنهادات دانشجویان در سراسر کشور فعالیت میکند. بدیهی است که مطالب و نظرات ارزشمند شما عزیزان ما را در این امر یاری خواهد کرد.

تدریس خصوصی کلیه دروس مهندسی برق و مهندسی پزشکی و انجام پروژه های پژوهشی و دانشجویی

shirazbme@sums.ac.ir
shiraz.bme@gmail.com

باتشکر مدیریت سایت (کارشناس ارشد مهندسی پزشکی-بیوالکتریک دانشگاه شیراز)
موضوعات
برگه ها
جستجو در وبلاگ
تاریخ: یکشنبه 13 دی 1394 09:45 ق.ظ

توضیحات کامل در مورد الایزا ریدر

در مطلب قبل با دستگاه الایزا و نحوه کالیبراسیون آن آشنا شدید. در این مطلب با دستگاه الایزا ریدر یا خوانشگر الایزا آشنا می شوید. الایزا ریدر را به نام های میکروپلیت ریدر و همچنین خوانشگر میکروپلیت فتومتریک نیز میشناسند.

الایزا ریدر یک اسپکتروفتومتر تخصصی بوده که به منظور قرائت نتایج تست الیزا طراحی شده است. این وسیله به منظور تعیین حضور آنتی بادی ها یا آنتی‌ژن های اختصاصی در نمونه ها به کار می‌رود. این تکنیک بر اساس تشخیص یک آنتی‌ژن یا آنتی بادی ها روی یک سطح جامد به صورت مستقیم یا ثانویه به کمک آنتی بادی های نشاندار و ایجاد محصولاتی استوار است که می‌توانند توسط اسپکتروفتومتر  خوانده شوند. واژه الایزا ELISA، اختصاری از کلمات Enzyme-Linked  Immuno  sorbent  Assay است.

shirazbme.ir الایزا ریدر (3)

کاربرد میکروپلیت ریدر
مــیــکـــروپــلــیـــت ریــدر بــرای خــوانــدن نـتــایــج تست‌های الایزا مورد استفاده قرار می گیرد. این تـکـنـیــک کــاربــردی مـسـتـقـیــم در ایـمـنــولــوژی و سـرولـوژی دارد. از مـیـان کـاربـردهـای دیگر این وسیله به تایید حضور آنتی بادی ها یا آنتی‌ژن‌های یک عامل عفونی در یک ارگانیزم، آنتی بادی های یـک واکـسـن یـا اتـوآنـتـی بـادی هـا بـرای مـثال در آرتریت روماتوئید می توان اشاره کرد.

اصول کار
الایـزا ریـدر یـک اسپکتـروفتـومتـر اختصـاصی است. بر خلاف اسپکتروفتومترهای معمولی که قرائت جذب نوری را در گستره وسیعی از طول موج ها تسهیل می کنند، الایزا ریدر دارای فیلترها یا گریتینگ های انکساری بوده که گستره طول موج ها را محدود کرده و معمولا بین ۴۰۰ تا ۷۵۰ نانومتر  عمل می کنند. برخی از الایزا ریدرها در گستـره مـاوراء بنفـش عمـل کرده و قرائت را در مـحــدوده ۳۴۰ تــا ۷۰۰ نـانـومتـر انجـام مـی دهنـد. سـیـستم نوری موجود در این دستگاه ها توسط تعدادی از کارخانه ها با استفاده از فیبرهای نوری به منظور تامین نور جهت چاهک های حاوی نمونه در میکرو پلیت طراحی می شود. ابتدا یک شعاع نوری از نمونه ای که دارای قطری بین ۱ تا ۳ میلی متر است عبور کرده و سپس یک سیستم آشکار کننده، نور عبوری از نمونه را آشکار و تقویت می کند. در مرحله بعد، سیگنال مربوط به جذب نوری نمونه‌ها ثبت شده و سیستم خوانشگر نیز آن را به اطلاعاتی تبدیل می کند که سبب تفسیر نتایج تست می شوند. برخی از الایزا ریدرها با استفاده از سیستم های شعاعی نوری دوتایی کار می کنند.
نمونه های مورد آزمایش در پلیت هایی که به این منظور طراحی شده اند و دارای تعداد خاصی چاهک هستند، قرار می گیرند. پلیت های ۸ ستونی همراه با ۱۲ ردیف که در مجموع ۹۶ چاهک را تشکیل می دهند، رایج تر از بقیه هستند. برای کاربردهای اختصاصی تر، تعداد چاهک ها افزایش می یابد که در برخی موارد تا پلیت های ۳۸۴ چاهکی را نیز شامل می شود. افزایش تعداد چاهک ها به منظور کاهش مقدار مصرف معرف ها و نمونه ها است. موقعیت سنسور نوری الایزا ریدر بر اساس نوع کارخانه سازنده متغییر است؛ به طوری که در برخی موارد ممکن است در بالای پلیت حاوی نمونه و گاهی نیز مستقیما در زیر پلیت قرار گیرد. امروزه میکرو پلیت ریدرها دارای کنترل هایی هستند که به وسیله میکروپروسسورها تنظیم شده اند.

وسایل لازم جهت انجام تکنیک الایزا  
جهت انجام آزمایش الایزا تجهیزات زیر مورد نیاز  است:
۱- الایزا ریدر
۲- میکرو پلیت واشر (شستشو دهنده چاهک ها)
۳- سیستم توزیع کننده مایع (که در این مورد ممکن است از پیپت ها چند کاناله استفاده شود)
۴- انکوباتور

تجهیزات مورد نیاز در انجام تست های الایزا
مراحل مکانیکی انجام تکنیک الایزا
یک تست الیزا به طور رایج شامل مراحل زیر است:
۱- شستشوی اولیه پلیت که ممکن است با استفاده از میکرو پلیت واشر انجام شود.
۲- استفاده از یک توزیع کننده مایع (دیسپنسر) یا پی پت چند کاناله.
۳- پلیت در انکوباتور قرار داده می شود که دارای دمای کنترل شده بوده و واکنش ها در آن محل انجام می شوند.
بسته به نوع تست، مراحل ۱، ۲ و ۳ ممکن است چـنـدین بار تکرار شوند، تا این که معرف‌های اضافه شده، واکنش ها را کامل کنند.
سـرانـجـام، وقـتـی تـمـام مـراحـل انـکوباسیون کامل شد، پلیت به الایزا ریدر منتقل شده و سپس بـا قـرائـت جـذب نـوری نمونه ها، نتیجه آن ها مشخص می شود.

مراحل بیوشیمیایی تکنیک الیزا
۱- چــــاهــــک هــــای مــــوجــــود در پــلــیــــت بــــا آنـتــی‌بــادی‌هــا و آنـتــی ژن هــا پــوشـیـده (Coat) می‌شوند.
۲- نـمــونــه هـا، کـنـتـرل هـا و اسـتـانـداردهـا بـه چاهک‌ها اضافه شده و در دمای اتاق  یا ۳۷ درجه سـانتیگـراد بـرای یـک مـدت زمـانی معین، طبق دستـورالعمـل تست انکوبه می شوند. در طول انکـوباسیون، بسته به حضور یا عدم حضور و مقدار آنتی ژن   یا آنتی بادی موجود در نمونه، آنتی ژن نمونه به آنتی بادی کوت شده به پلیت، یا آنتی بادی موجود در نمونه به آنتی ژن Coat شده در پلیت باند می شود.
۳- پـــس از انـکـــوبـــاسـیـــون، آنـتـــی ژن‌هــا  یــا آنـتــی‌بــادی‌هــای آزاد، شـسـتشـو داده شـده و بـا اســتــفـــاده از مـیـکــرو پـلـیــت واشــر و یــک بــافــر شستشوی مناسب، برداشته می شوند.
۴- در مرحله بعد، یک آنتی بادی ثانویه، به نام کونژوگه، اضافه شده که حاوی آنزیمی است که به منظور ایجاد یک تغییر رنگی، با یک سوبسترا واکنش خواهد داد.
۵- ســـپــــس یــــک دوره زمــــانــــی ثــــانــــویــــه از انـکــوبــاسـیـون شـروع مـی شـود کـه در طـی آن، کـونـژوگـه بـا کمپلکس آنتی ژن- آنتی بادی در چاهک ها پیوند برقرار خواهد کرد.
۶- پس از انکوباسیون، یک دوره شستشوی جدید انجام می شود که سبب برداشت کونژوگه متصل نشده از چاهک ها خواهد شد.
۷- در مرحله بعد، سوبسترا اضافه می شود. آنـزیـم بـا سـوبستـرا واکنش خواهد داد و سبب تغییر رنگ محلول خواهد شد. این واکنش نشان خواهد داد که چه مقدار کمپلکس آنتی‌ژن- آنتی بادی در پایان تست وجود خواهد داشت.
۸- وقتی که زمان انکوباسیون کامل می شود، یک معرف برای توقف واکنش آنزیم- سوبسترا به آن اضافه شده که از تغییرات بیشتر در شدت رنگ ایجاد شده، جلوگیری می‌کند. این معرف عموما یک اسید رقیق است.
۹- در پایان، پلیت بوسیله الایزا ریدر خوانده می شود. نتایج حاصله برای تعیین مقادیر اختصاصی یا حضور آنتی ژن ها یا آنتی بادی ها در نمونه به کار برده می شوند.
تــوجـه: بـرخـی از چـاهـک هـا بـرای استـانـداردهـا و کنتـرل هـا استفـاده مـی شـونـد. استانداردها برای تعریف نقاط cut-off به کار برده می شوند. استانداردها و کنترل ها مـقـادیر معینی هستند و برای اندازه گیری نتایج تست و ارزیابی اطلاعات در مقابل غلظت‌های مشخصی برای هر کنترل به کار برده می شوند. فرایند توصیف شده در بالا عمومی است؛ اگرچه بسیاری از تست های الایزا وجود دارند که همراه با مراحل یا متغیرهای اختصاصی هستند.


نصب تجهیزات
به منظور عملکرد صحیح الایزا ریدر، نکات زیر لازم است تا رعایت شود:
۱- یک محیط تمیز و عاری از گرد و غبار
۲- یک میز کار ثابت و به دور از تجهیزاتی از قبیل سانتریفوژ، شیکر و … که سبب لرزش آن می شوند. این میز باید دارای اندازه مناسبی باشد  به طوری که در کنار الایزا ریدر، فضای کاری مناسبی وجود داشته باشد. تجهیزات تکمیلی مورد نیاز برای انجام تکنیک توصیفی بالا عبارتند از: واشر، انکوباتور، دیسپنسر و کامپیوتر همراه با وسایل جانبی آن.
۳- یک منبع تغذیه الکتریکی، که سازگار با استانداردها و معیارهای کشور باشد. در کشورهای آمریکایی به طور مثال، عموما فرکانس های ۶۰ هرتز و ۱۱۰ ولت استفاده می‌شود، در حالی که در نواحی دیگر از جهان ۲۲۰ تا ۲۴۰ ولت و ۵۰ تا ۶۰ هرتز به کار برده می شود.

shirazbme.ir الایزا ریدر (1)

کالیبراسیون الایزا ریدر
کالیبراسیون الایزا ریدر، یک مرحله اختصاصی است که باید توسط یک تکنسین یا مهندس آموزش دیده که به دستورالعمل های سازنده دستگاه آشنایی دارد، انجام شود. بـرای انجـام کالیبراسیون، داشتن یک مجموعه از فیلترها که از لحاظ اندازه، یکسان هستند، الزامی است. سازندگان این دستگاه ها، پلیت های کالیبراسیون را برای هر طول موجی که دستگاه به کار می برد فراهم می کنند.
پلیت های کالیبراسیون مجهز به حداقل سه مقدار جذب نوری از قبل تعیین شده (پایین، متوسط و مقدار بالا)، در دامنه اندازه گیری هستند.
برای انجام کالیبراسیون مراحل زیر را باید دنبال کرد:
۱- پلیت کالیبراسیون را روی دستگاه قرار دهید.
۲- یـک خـوانـش کـامـل را بـا پلیـت کـالیبراسیون انجام دهید. مشخص کنید که آیا تفاوت‌هایی در قرائت های به دست آمده از یک چاهک به چاهک دیگر وجود دارد یا خیر. چنانچه اختلافی مشاهده شد، پلیت را به اندازه ۱۸۰ درجه چرخانده و قرائت را مجددا تکرار کنید تا    از اختلافاتی که به خود پلیت نسبت داده می شوند، جلوگیری کنید. به طور کلی، اگر نتایج پلیت در دو طول موج، به میزانی باشد که انتظار داریم، گفته می‌شود که دستگاه به کالیبراسیون دیگری احتیاج ندارد.
۳- تایید کنید آیا خوانشگر به کالیبراسیون احتیاج دارد یا خیر. چنانچه به کالیبراسیون احتیاج دارد، راهنمایی های  رایج کارخانه سازنده دستگاه را برای کالیبراسیون دنبال کنید. تایید کنید که خطی بودن )linearity( خوانشگر تا حد امکان قابل قبول است.
۴- اگــر دستگـاه حـاوی یـک پلیـت کـالیبـراسیـون نیسـت، یـک محلـول رنگـی را در چاهک‌های یک پلیت از آن ریخته و فوری نتایج را قرائت کنید. سپس پلیت را به اندازه ۱۸۰ درجه چرخانده و دوباره قرائت را انجام دهید. اگر هر دو خوانش ها و میانگین مقادیر در هر ردیف یکسان هستند، خوانشگر کالیبر است.
۵- تایید کنید که خوانشگر به صورت ستون به ستون نیز کالیبر است. یک پلیت تمیز و خالی را  در محل مخصوص قرار دهید و قرائت را انجام دهید. اگر اختلافی بین هر یک از خوانش های میانگین از اولین تا آخرین ستون وجود ندارد، می توان فرض را بر این گذاشت که خوانشگر کالیبر است.

حفظ و نگهداری رایج
‌نـگـهــداری اســاســی (تـکـرار بـه صـورت روزانه)
۱- مـرور ایـنـکـه سنسورهای نوری هر کانال تـمـیـز هـسـتـنـد. چـنـانـچـه کـثـیـف هـستند، سطح پنجره‌‌های عبور دهنده نور و سنسورها را با یک برس کوچک تمیز کنید.
۲- تایید کنید که سیستم نوری تمیز  است.
۳- تایید کنید که کالیبراسیون خوانشگر کافی اسـت. وقـتـی کـارهـای روزانه شروع می شود، اجـازه دهـید تا خوانشگر برای مدت ۳۰ دقیقه گرم شود. در مرحله بعد، قرائت Blank را انجام دهـیـد و سـپـس یـک پـلیت کامل از سوبسترا را قـرائـت کـنـیـد. خـوانـش هـا مـی بـایـست یکسان بـاشند. اگر این طور نبود، پلیت را چرخانده و قرائت را به منظور تعیین این که آیا اختلاف در پلیت یا در خوانشگر است، تکرار کنید.
۴- سـیـسـتــم کـشـنــده اتــومــاتـیــک اســلایــدهـا (Automatic drawer sliding system) را بــررسـی کنید که باید نرم و ثابت باشد.

‌نـگـهـداری بـازدارنـده (تـکـرار هـر سه ماه یکبار)
۱- پـــایـــداری لامـــپ را تـــایـیــد کـنـیــد. پـلـیــت کالیبراسیون را به کار برده، قرائت را با فاصله ۳۰ دقیقه مجددا با همان پلیت انجام دهید. قرائت ها را مقایسه کنید که هیچ تفاوتی نباید میان آن ها مشاهده شود.
۲- سیستم نوری دتکتور و سیستم های نوری را تمیز کنید.
۳- کشنده پلیت (Plate drawer) را تمیز کنید.
۴- مکان قرار گیری هر چاهک را با استفاده از سـیـسـتـم هـای انتشار نور و آشکار  کننده تایید کنید

روش کار

ست الایزا را در حالت معمول برای ردیابی آنتی ژن یا آنتی بادی بکار می برند بدین ترتیب که یکی از این دو ماده در بستر جامد ثابت می شود و برای ردیابی دومی بکار گرفته می شود، اما اساسا برای ردیابی هر جفت ماده ای که مثل جفت آنتی ژن و آنتی بادی به هم گرایش داشته و قدرت اتصال مناسبی نسبت به هم دارند میتواند بکار گرفته شود (مثلا لکتین به لیگاند مربوطه اش یا مولکول به گیرنده اختصاصی اش) البته این پدیده یعنی اتصال بین دو ماده ای که آنتی بادی و آنتی ژن نیستند اما گرایش به هم دارند اغلب اوقات مشکل آفرین است و برای بالا بردن حساسیت و اختصاصیت اتصال بین آنتی بادی و آنتی ژن در الایزا باید این اتصالات ناخواسته را به طریقی مهار کرده و یا کارهای جبرانی لازم را در نظر گرفت.

۱ ) تست الیزا برای جستجوی آنتی ژن: ELISA روش بسیار حساسی است که (معمولا) برای جستجوی آنتی ژن یا آنتی بادی بکار میرود در تحت شرایط تنظیم شده (از نظر غلظت یونی و pH) پروتئین ها (آنتی ژن یا آنتی بادی) به طور خودبخود تمایل دارند که به بستر جامد (در این تست plate هایی از جنس پلی استیرن) متصل شوند، ماهیت این اتصال بخوبی معلوم نشده است اما برگشت پذیر بوده و با استفاده از pH های بالاتر یا پایین تر و استفاده از غلظت های یونی بالا اتصال قطع میشود این نوع اتصال خودبخودی اگر چه ظرفیت محدودی دارد ولی با بکارگیری سیستم های تقویتی مناسبی مثل سیستم آنزیم-سوبسترا این اتصالات وسیله بسیار خوبی برای طراحی سیستم الایزا گردیده است.

shirazbme.ir الایزا ریدر (2)

برای انجام الایزا:

۱ ) ابتدا باید پروتئین مورد نظر را به کف پلیت چسباند.

۲ ) نقاط اتصال باقی مانده را باید با محلول پروتئینی مناسب مسدود کرد.

۳ ) محلول مورد آزمایش را اضافه کرد تا دو ماده همدیگر را پیدا کرده و متصل شوند.

۴ ) سیستم های تقویتی اولیه را برای افزایش حساسیت آزمایش بکار گرفت.

۵ ) سیستم آنزیمی نهایی را به راه انداخته و رنگ نهایی تولید شده را اندازه گرفت حال این ۵ مرحله به تفکیک توضیح داده می شوند:

 

۱ ) اتصال پروتئین به کف پلیت (Coating): آنتی ژن (یا آنتی بادی) در مقادیری در حدود میکروگرم به داخل چاهک پلیت الایزا اضافه شده و فرصت داده میشود تا به مقدار کافی به کف چاهک (well) متصل شود برای اینکار بسته به نوع پروتئین بافرهای مختلفی به کار گرفته می شود و غلظت پروتئین نیز باید مناسب سازی شود در مقادیر بسیار پایین حساسیت ردیابی پایین می آید و در مقادیر بالای آنتی ژن اتصالات سستی نیز برقرار میشود که در مراحل بعدی کنده شده و هنگام شستشو آنتی ژن همراه با آنتی بادی اختصاصی دفع می شوند و لذا حساسیت تست مجددا پایین می آید. بطور کلی این مرحله اساسی بوده و نقش زیادی در نتیجه نهایی دارد .

ایده آل های مورد انتظار برای این مرحله اینها هستند:

  • الف) مقدار آنتی ژن متصل شده به کف همه چاهک های یک پلیت باید یکنواخت باشند و کمترین واریانس را در نتیجه ایجاد کنند، بدین معنی که وقتی یک نمونه واحد را در چند چاهک مختلف منتقل نموده و آزمایش کنیم باید نتایج بدست آمده به هم نزدیک بوده و حداقل خطا را نشان دهند. همچنین اگر آزمایش مورد نظر در حجم بالا انجام میگیرد و چند پلیت را هم زمان کوت نموده و استفاده میکنیم باید جنس پلیت ها و شرکت تهیه کننده آنها یکسان باشد تا از خطای مربوط به تفاوت در قدرت اتصال پلیت ها جلوگیری شود و ترجیحا بافر کوتینگ و زمان کوتینگ و محلول آنتی ژنی آماده شده برای کوتینگ بهتر است یکسان باشند.
  • ب) اتصالات برقرار شده بین آنتی ژن و بستر جامد باید به اندازه کافی محکم و قوی باشند تا در مراحل شستشوی بعدی کنده نشوند، معمولا برای آنتی ژن های عادی، اتصال دهنده اضافی لازم نیست ولی اگر آنتی ژنی استثنائاً با روش معمول به کف پلیت نچسبید یا اتصالات سستی برقرار کرد از مواد و روش های خاصی برای اتصال آنتی ژن به کف بستر استفاده می شود (مثلاً استفاده از گلوتارآلدئید یا اشعه ایکس یا …).
  • ج) پروتئین متصل شده نباید آنقدر کم باشد که نتواند مقادیر بالای آنتی بادی را جذب کند در این صورت غلظت های بالای آنتی بادی قابل تشخیص نخواهد بود از طرفی پروتئین متصل شده نباید آنقدر زیاد باشد که اتصالات غیراختصاصی از اتصالات اختصاصی بیشتر شوند که در این صورت جواب آزمایش قابل اغتماد نخواهد بود برای تامین این سه هدف تمهیدات خاصی به کار گرفته می شوند که در فرصتی مناسب توضیح داده خواهند شد.

۲ ) مرحله مسدود سازی یا بلوکینگ (blocking): نقاطی از کف پلیت که با پروتئین اختصاصی پوشانده نشده اند با استفاده از محلول های پروتئینی خنثی (از این نظر که در واکنش اختصاصی بعدی اثر سوئی ندارد) پوشانده می شوند محلول های پروتئینی برای این منظور حاوی شیر کم چربی یا آلبومین گاوی یا ژلاتین و یا کازئین میباشند. علاوه بر پروتئین از دترژانت های غیر یونی خاصی نظیر Tween 20 یا Tween 80 یا … نیز به عنوان کمکی استفاده می شوند نوع این مواد و مقادیر بکار برده شده به صورت تجربی تعیین می شوند و با توجه به تجربیات دیگران می توان محدوده خاصی را برای کار مورد نظر امتحان کرد و بهترین غلظت را بدست آورد (چون پروتئین ها از ریشه های جانبی متفاوتی برخوردارند لذا برای پروتئین های بسیار خالص مثل پروتئین های ریکامبینانت مناسب سازی این ترکیبات در بالا بردن اعتبار نتایج بسیار کمک کننده خواهد بود). علاوه بر پروتئین و دترژانت، غلظت یونی بافر بلوک کننده نیز اهمیت زیادی دارد و برای اتصال انتخابی پروتئین مورد نظر (از میان مخلوط پروتئینی) میتوان بافرهای مختلف و غلظت یونی متفاوت را ارزیابی کرده و بهترین بافر را برای آزمایش مورد نظر بدست آورد.

۳ ) اتصال آنتی ژن و آنتی بادی محلول مورد آزمایش که احتمال میرود حاوی مقادیر قابل ردیابی از آنتی بادی بر علیه آنتی ژن اختصاصی موجود در کف پلیت میباشد در این مرحله در بافر مناسبی تهیه شده و اضافه می شود آنتی بادی شناور در محلول، آنتی ژن متصل به بستر را پیدا کرده و به آن متصل می شود بندرت این آنتی بادی متصل به آنزیم است اما در اغلب اوقات کونژوگه آنزیمدار در مرحله بعدی بکار گرفته می شود. آنتی بادی های متصل نشده با عمل شستشو از محیط حذف می شوند بافر شستشو معمولا دارای پروتئین خنثی به کار گرفته شده در محلول بلوکان است. چرا؟ حاوی دترژانت میباشد. چرا؟ و از نظر قدرت و pH بافری مناسب برای اتصال آنتی ژن با آنتی بادی است. آنتی بادی ها، سرم ، و محلولهای بکار گرفته شده در مراحل مختلف الایزا معمولا در بافر شستشو رقیق می شوند.

۴ ) سیستم های تقویتی اولیه سیستم تقویتی اولیه قبل از سیستم تقویتی اصلی (که همانا بکار گرفتن خصوصیت آنزیمهاست) میباشد در این مرحله ما واکنش های اضافه تری را به کار میگیریم تا قدرت اندازه گیری تست (حساسیت و اختصاصیت) بالا برده شود. بدین منظور از قدرت تقویت کنندگی بیوتین-آویدین، بیوتین-استرپتاویدین، لکتین-لیگاند و … استفاده می شود.

۵ ) تقویت آنزیمی هر آنزیمی بر روی سوبسترای اختصاصی خود اثر کرده و آنرا به محصول تبدیل می کند این واکنش در طی زمان منجر به جمع شدن مقدار متنابهی از محصول در محیط می شود بدین معنی که با گذشت زمان معینی یک مولکول آنزیم می تواند مولکول های سوبسترای بسیاری را به محصول تبدیل کند این اثر افزایشی در حقیقت اساس الایزا را تشکیل میدهد.

بدین ترتیب که آنتی بادی نهایی باقی مانده پس از شستشوی نهایی با مولکول آنزیم متصل است و افزودن سوبسترا در طی زمان معینی (مثلاً یک ساعت) منجر به آزاد سازی مقادیر متنابهی سوبسترا می گردد که یا خود رنگی میباشد یا در واکنش با ماده دیگری (کروموژن یا رنگزا) که به محیط اضافه شده است رنگ تولید میکند در نهایت رنگ تولید شده توسط دستگاه قرائت کننده مخصوصی خوانده شده و محاسبات لازم بر روی داده های بدست آمده انجام می گیرد اساس تست Sandwich ELISA برای اندازه گیری سیتوکین در روش الایزای ساندویچی مولکول اندازه گیری شده در واقع در بین دو مولکول مختلف آنتی بادی قرار میگیرد (ساندویچ میشود) مثلا این روش را در مورد اندازه گیری سایتوکاین اینترفرون گاما شرح میدهیم:

اساس: سلول های طحالی گرفته شده از موش های دریافت کننده واکسن در اثر تحریک با آنتی ژن اختصاصی در محیط کشت تکثیر پیدا خواهند کرد برای تعیین اینکه غالب سلول های تکثیر یابنده از نوع Th1 هستند یا Th2 باید پروفیل سیتوکینی در محیط کشت مشخص شود بدین منظور تعیین مقدار سیتوکین های IL-4 و IFN-g ترشح شده توسط سلول ها در محیط کشت مد نظر قرار میگیرد. چنانکه در شکل زیر مشخص شده است در این روش آنتی بادی منوکلونال ضد آنتی ژن به کف plate چسبانده میشود سپس فرصت داده میشود تا آنتی ژن (در این تحقیق سیتوکین IL-4 و IFN-g ) به آن متصل شود در مرحله بعدی آنتی بادی پلی کلونال ضد آنتی ژن اضافه میشود که متصل به آنزیم پراکسیداز HRP است و اضافه شدن سوبسترا همراه با کروموژن منجر به ایجاد محصول رنگی میشود که توسط دستگاه ELISA Reader قرائت میگردد چون در این روش آنتی ژن در بین دو آنتی بادی قرار میگیرد لذا به ساندویچ مشهور شده است.

منبع:دپارتمان مرکزی مهندسی پزشکی

تازه ترین مطالب
لینکدونی
ابزارک ها
  • کل بازدید:
  • بازدید امروز :
  • یازدید دیروز :
  • بازدید این ماه :
  • بازدید ماه قبل :
  • تعداد نویسندگان :
  • تعداد کل مطالب :
  • آخرین بازدید :
  • آخرین بروز رسانی :


-*-*-*-*-*-*-*-*-*-*-*-*-*- *---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*

.

*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---* *---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---* *---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---* *---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---* *---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---*---* PRchecker.info -----------

  • به کدام مطالب حوزه مهندسی و پزشکی بیشتر علاقمندید؟